Bakteriofagi

Stan lizogenii

Konwersja lizogeniczna

Wykrywanie szczepów lizogennych fagiem l.

Jak oznaczyć wrażliwość bakterii na bakteriofagi (ang. streak-test)

Jak przygotować lizat fagowy?

Jak oznaczyć miano lizatu fagowego?

Przenoszenie materiału genetycznego za pomocą faga - transdukcja

Strony www o fagach

 

 

Bakteriofagi E.coli

 

 

Zakażenie wirusem komórek E. coli nie zawsze musi prowadzić do natychmiastowej śmierci komórki.

Liza bakterii następuje zawsze w przypadku fagów zjadliwych (wirulentych). Przykładem fagów wirulentnych wchodzących zawsze na drogę lityczną są bakteriofagi z serii T.

Fagi określane jako łagodne po wniknięciu do komórki „decydują” – w zależności od czynników środowiskowych – czy wejść na drogę lizogeniczną tj. pozostawać w fazie utajenia czy wejść na drogę lityczną. Do takich wirusów należą m. in. fagi lambda, P1, Mu. Fagi łagodne określane jako vir posiadają mutację, wskutek czego zakażenie tymi fagami zawsze prowadzi do lizy komórki

Z kolei, wirusy f1, fd oraz M13, dla których receptorem są pile płciowe, nie prowadzą do lizy bakterii. Dojrzałe wiriony wydzielane są poprzez błonę na zewnątrz komórki bakteryjnej.

 

Struktura genomu bakteriofagów E. coli  (zobacz slajd)

 

 

 

 

 

Lizogenia

 

Liczne bakteriofagi łagodne, których genom stanowi dwuniciowy DNA zdolne są do lizogenizacji bakterii.

W stanie lizogenii większość genów fagowych nie podlega ekspresji, a fag pozostaje w komórce bakteryjnej „w stanie uśpienia” (profaga). W tym czasie DNA bakteriofaga może być zintegrowane z chromosomem bakteryjnym (tak się dzieje np. z fagiem lambda lub fagiem Mu) lub pozostawać w postaci plazmidu (np. bakteriofag P1)

W przypadku bakteriofaga lambda, miejsce integracji DNA fagowego z DNA bakterii Escherichia coli leży pomiędzy genami gal warunkującymi zdolność do fermentacji galaktozy a genami bio odpowiedzialnymi za zdolność bakterii do syntezy biotyny.

 

Bakteria lizogenna jest oporna na ponowne zakażenie takim samym bakteriofagiem, może jednak być zakażana innym fagiem, nawet lizogenizującym, ale integrującym w innym miejscu genoforu komórki.

 

Konwersja lizogeniczna

 

Obecność profaga w komórce może wpływać na fenotyp bakterii np. na właściwości wirulentne.

Przykładem są bakterie Corynebacterium diphteriae wywołujące błonicę.

Także erytrogenna toksyna bakterii Streptococcus pyogenes odpowiedzialna za wysypkę płoniczą kodowana jest przez bakteriofaga.

 

Bakterie Vibrio cholerae nabywają dodatkowe cechy zjadliwości po lizogenizacji fagiem CTX -  przeczytaj: Wiedza i Życie nr 12/1996

 

 

 

 

 

 

Wykrywanie szczepów lizogennych fagiem l

 

Do badania należy użyć szczepu Escherichia coli lcI857ts.

1.       Nocną hodowlę szczepu Escherichia coli lizogennego fagiem lambda odmłodzić przez rozcieńczenie 1:10 w 20 ml świeżej pożywki

2.       Bakterie inkubować 1,5 godziny w temperaturze 30oC. Po tym czasie zmierzyć gęstość optyczną hodowli.

3.       Wstawić hodowlę na 15 minut do łaźni wodnej o temp. 43oC – wskutek denaturacji zmutowanego represora CI następuje indukcja profaga

4.        Bakterie hodować jeszcze przez godzinę w temperaturze 37oC.

5.       Ponownie zmierzyć gęstość optyczną hodowli i porównać uzyskane wartości. Obserwować przejaśnienie hodowli bakteryjnej.

 

 

 

 

 

 

Oznaczanie wrażliwości bakterii na bakteriofagi (ang. streak-test).

 

Do streak-testu należy zastosować następujące szczepy:

§          Escherichia coli A17 l-lS,

§          Escherichia coli A135 l-lR,

§          Escherichia coli L2 l+lS,

§          Escherichia coli A142 [ldv] lS,

§          Escherichia coli A40 dnaB

§          Salmonella anatum.

 

  1. Na płytkach z podłożem agarowym nanieść w postaci kreski około 0,1 ml lizatu fagowego bakteriofaga l lub T4.
  2. Po wsiąknięciu lizatu (!), za pomocą jałowych wykałaczek pobrać materiał z kolonii bakteryjnych i przeciągnąć przez linię z naniesionym lizatem fagowym.
  3. Płytki inkubować 24 godziny w temperaturze 37oC.

 

Określić jaka jest wrażliwość bakterii na użyte bakteriofagi. Jeżeli po kontakcie z fagiem nie jest widoczny wzrost bakterii to znaczy, że badany szczep bakteryjny jest wrażliwy na danego bakteriofaga. Natomiast normalny wzrost bakterii po kontakcie z bakteriofagiem świadczy o oporności tego szczepu na danego bakteriofaga.

 

 

 

 

 

Przygotowanie lizatu fagowego

 

1.       Nocną hodowlę bakterii E. coli (dawca) rozcieńczyć 1:100 w pożywce LB (100ml bakterii + 9.9 ml pożywki LB)

2.        Bakterie hodować przez około 45 minut w 37oC, do OD600 = 0,2.

3.       Po tym czasie dodać 0.1 ml 1M CaCl2 (do stężenia końcowego około 10 mM) oraz 75 ml lizatu bakteriofaga P1vir.

4.       Całość wytrząsać 2-3 godziny do czasu całkowitej lizy komórek bakteryjnych (następuje wyraźne przejaśnienie hodowli).

5.       Po odwirowaniu szczątków bakteryjnych lizat przechowuje się w temperaturze 4oC w obecności chloroformu.

 

 

 

 

 

Transdukcja ogólna z wykorzystaniem bakteriofaga P1vir

 

Metoda ta wykorzystuje naturalne właściwości bakteriofaga P1 polegające na tym, że może on przenosić (transdukować) fragmenty chromosomu E.coli o wielkości do 100kb. Zdolność ta została wykorzystana  w mapowaniu genów chromosomalnych i plazmidowych, oraz w przenoszeniu (transdukcji) homologicznych fragmentów DNA, z chromosomu dawcy do chromosomu biorcy.

Proces ten zwany transdukcją ogólną zachodzi z częstością 10-5-10-8/komórkę dla różnych genów, bez względu na ich położenie na chromosomie. Jeżeli dwa geny są zlokalizowane blisko siebie (ściśle sprzężone) to mogą być przeniesione przez te samą cząstkę fagową (kotransdukcja). Częstość kotransdukcji maleje ze wzrostem odległości między dwoma genami. Znaczniki genetyczne leżące w odległości większej niż 100 kb nie mogą być kotransdukowane.

Do transdukcji ogólnej używa się faga P1vir, który zawsze wchodzi na drogę lityczną i który z bardzo małą częstością, w wyniku „błędu”, pakuje do główki potomnej DNA gospodarza zamiast własnego genomu. Po infekcji mieszaniną bakteriofagów potomnych, taki DNA nie może się replikować, ale może być zrekombinowany z chromosomem biorcy na zasadzie rekombinacji homologicznej katalizowanej m.in. przez białko RecA.

 

W poniższym doświadczeniu przenosimy dwie cechy: zdolność do rozkładu laktozy (fenotyp Lac+), oporność na tetracyklinę (Tetr)

 

  1. W probówce Eppendorfa przygotować mieszaninę do transdukcji zawierającą:

·          0,1 ml nocnej hodowli szczepu biorcy (fenotyp Lac- Tets)

·          x ml  lizatu fagowego P1 (namnożonego na szczepie dawcy Lac+ Tetr); x = od 20 do 100 ml lizatu fagowego

·          20 ml 100mM CaCl2.

 

  1. Mieszaninę inkubować 20 min w cieplarce, w temp. 37oC.
  2. Po tym czasie dodać roztwór cytrynianu sodu do końcowego stężenia 10 mM (24 ml 0.1M roztworu).
  3. Następnie dodać  0,6 ml LB i inkubować hodowlę w temp. 37oC jeszcze przez 30 min.
  4. Po tym czasie wcierać transduktanty (200 ml) na płytki McConckeya z tetracykliną (15mg/ml), laktozą (1%) i 10 mM cytrynianem sodu
  5. Dodatkowo należy wykonać następujące posiewy kontrolne:

§          posiew izolacyjny dawcy na płytkę z podłożem McConkey’a uzupełnionym tetracykliną.

§          posiew izolacyjny dawcy na płytkę z podłożem McConkey’a.

§          posiew izolacyjny biorcy na płytkę z podłożem McConkey’a uzupełnionym tetracykliną.

§          posiew izolacyjny biorcy na płytkę z podłożem McConkey’a.

  1. Płytki inkubować przez noc w temperaturze 37oC. Po tym czasie obserwować wyrosłe kolonie bakteryjne.

 

 

 

 

Strony www

 

Ciekawe mikrobiologiczne strony www

 

 

 

 

 

 

Ó Anna-Karina Kaczorowska