Oznaczanie miana hodowli bakteryjnej
Oznaczanie miana lizatu fagowego
¨
Stosowana jest od określania
liczby bakterii (miano hodowli) lub cząstek fagowych (miano lizatu) w 1 ml.
¨
Służy także do otrzymywania czystej
kultury bakteryjnej – zawiesinę bakterii rozcieńczany tak, aby po wysianiu
ostatniego rozcieńczenia uzyskać na płytkach Petriego pojedyncze kolonie
bakteryjne.
Oznaczanie miana hodowli bakteryjnej
(Bezpośrednie
określanie liczby bakterii w hodowli)
Wykorzystuje się metodę seryjnych
rozcieńczeń – trzeba przygotować kolejne rozcieńczenia hodowli bakterii w
roztworze soli fizjologicznej (0,85% NaCl).
1)
Do sześciu, ponumerowanych jałowych probówek rozlać po 4,5
ml jałowego roztworu soli fizjologicznej
2)
Do pierwszej probówki dodać 0,5 ml hodowli bakteryjnej,
zawartość probówki dobrze wymieszać.
3)
Przenieść 0,5 ml rozcieńczonej dziesięciokrotnie zawiesiny
bakteryjnej do następnej probówki i ponownie dokładnie wymieszać.
4)
Analogicznie wykonać pozostałe rozcieńczenia. Przy każdym
kolejnym rozcieńczeniu miano bakterii zmniejsza się dziesięciokrotnie.
5)
Z trzech ostatnich rozcieńczeń pobrać po 0,1 ml zawiesiny
bakteryjnej, a następnie dokładnie rozprowadzić jałową głaszczką po powierzchni
płytek z agarem wzbogaconym. (Do każdego posiewu użyć osobnej płytki).
6)
Płytki inkubować 24 godziny w temperaturze 37oC.
7)
Na następnych zajęciach należy policzyć kolonie, które
wyrosły na płytkach.
Zakładając, że pojedyncza kolonia powstaje z jednej komórki bakteryjnej można określić liczbę żywych komórek obecnych w 1 ml badanej hodowli (miano bakterii) posługując się następującym wzorem:
|
n
|
N
- miano hodowli bakteryjnej (liczba bakterii w 1 ml)
n
- liczbę kolonii, które wyrosły na płytce przy danym rozcieńczeniu
10R – rozcieńczenie hodowli
V
– objętość wysianej próby
Np. na płytce, na której wysiano 0,1 ml rozcieńczenia 10 - 6 hodowli, wyrosło 28 kolonii
miano hodowli
wynosi zatem: N = 28 x 10 6 x 10 = 28 x 10 7
Oznaczanie
miana lizatu fagowego (miareczkowanie faga)
Wykorzystuje się metodę seryjnych
rozcieńczeń – trzeba przygotować kolejne rozcieńczenia lizatu fagowego.
Np. na ćwiczeniach używacie lizatu bakteriofaga lambda (lcb2)
1)
rozcieńczyć lizat fagowy do 10-6 w buforze TM. Buforu zawiera 10 mM
Tris-HCl o pH 7,4 oraz 10 mM MgCl2
2)
do trzech probówek Wassermana dodać po 0,1 ml rozcieńczenia faga 10-4, 10-5, 10-6
3) do probówek
dodać 0,1 ml hodowli nocnej szczepu indykatorowego E. coli A17 l-lS
4)
następnie dodać 3 ml
rozpuszczonego i schłodzonego do 45oC podłoża (bulion zawierający
0.7% agar – tzw. agar górny)
5)
szybko wymieszać i wylać na powierzchnię płytki z agarem
dolnym
6)
płytki inkubować 24 godziny w temperaturze 37oC.
7)
po inkubacji policzyć liczbę łysinek
Obliczyć miano faga czyli
liczbę cząstek fagowych w 1 ml zawiesiny według następującego wzoru:
|
Mf = n ´ 10R ´ 10 |
Mf - miano faga
n - ilość łysinek fagowych
10R - rozcieńczenie lizatu fagowego
10 - należy pomnożyć razy 10 gdyż na płytkę wysiewa się
0,1 ml lizatu fagowego
Np. na płytce, na której wysiano rozcieńczenie 10 - 6 lizatu, zaobserwowano 28 łysinek
miano lizatu
wynosi zatem: N = 28 x 10 - 6 x
10 = 28 x 10 - 5
Ó
Anna-Karina Kaczorowska