Oczyszczanie plazmidowego DNA

Protokół laboratoryjny oczyszczania DNA plazmidowego metodą lizy alkalicznej

Wektory plazmidowe – bazy danych na temat wektorów plazmidowych

Baza danych na temat enzymów restrykcyjnych

 

 

 

Oczyszczanie plazmidowego DNA

 

Istnieje kilkanaście metod oczyszczania plazmidowego DNA. W każdej z nich kluczowym momentem jest etap oddzielania plazmidów od chromosomalnego DNA. Większość metod stosowanych do oczyszczania plazmidowego DNA wykorzystuje fakt jego występowania w formie superzwiniętej (ang. covalently-closed-circular, w skrócie CCC).

Jedną z najpowszechniej stosowanych technik oczyszczania plazmidowego DNA jest metoda lizy alkalicznej zaproponowana przez Birnboima i Doly w 1979 roku. W metodzie tej, liza bakterii i denaturacja chromosomalnego DNA następuje na skutek działania alkaliów (0,2 M NaOH) i jonowego detergentu (1% SDS). W warunkach denaturacji,  liniowe cząsteczki dwuniciowego DNA (chromosom bakteryjny, a także formy plazmidowe OC, ang. open circular) ulegają rozwinięciu do formy jednoniciowej, natomiast superzwinięte cząsteczki DNA plazmidowego (CCC) pozostają dalej splecione i nie ulegają destrukcji. Obecny w mieszaninie lizującej detergent jonowy - siarczan dodecylu (1%) opłaszcza białka. Konsekwencją neutralizowania lizatów komórkowych octanem potasu jest wytrącanie zdenaturowanego chromosomalnego DNA (przypadkowa agregacja jednoniciowych fragmentów prowadzi do tworzenia nierozpuszczalnych kompleksów) oraz opłaszczonych siarczanem dodecylu białek (SDS wytrąca się w szczególnie efektywnie w roztworach zawierających jony potasu).

Metoda lizy alkalicznej służy do szybkiej izolacji plazmidowego DNA. Otrzymane DNA nadaje się do analizy restrykcyjnej i sekwencjonowania.

 

 

 

 

 

Protokół laboratoryjny

 

1.       Zaszczepić pojedynczą kolonią szczepu bakteryjnego E. coli JM 109 niosącego plazmid pUC19 w 5 ml pożywki LB uzupełnionej ampicyliną do stężenia 100 mg/ml (hodowlę prowadzić w probówkach). Bakterie hodować 12 godzin w wytrząsarce wodnej o temperaturze 37°C.

2.       Bakterie osadzić przez wirowanie (1 min. 10000 obr./min). Supernatant odrzucić. W przypadku oczyszczania wysokokopijnego plazmidu (jest nim pUC19) wystarczy do jego izolacji użyć 1,5 ml hodowli bakteryjnej (pojemność probówki Eppendorfa to około 1.8 ml). W innym przypadku należy osadzić bakterie z 5 ml hodowli.

3.       Osad bakteryjny zawiesić w 100 µl buforu lizozymowego o składzie: 25 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM glukoza i 10 mM EDTA. Skutecznym sposobem na zawieszenie bakterii we wspomnianym buforze jest pocieracie dnem probówek o otwory w statywie.

4.       Dodać 200 µl świeżo przygotowanej mieszaniny lizującej NaOH/SDS (9 części 0,2 M NaOH i 1 część 10 % SDS). Całość delikatnie wymieszać przez kilkukrotne odwrócenie probówki. Inkubować na stole przez 5 minut.

5.       Dodać 150 µl roztworu octanu potasu (przygotowuje się go przez zmieszanie 60 ml 5 M octanu potasu, 11,5 ml lodowatego kwasu octowego i 28,5 ml wody). Zawartość probówki wymieszać przez energiczne wytrzasąnie.

6.       Dodać 300 µl mieszaniny zbuforowanego fenolu i chloroformu (w proporcji v/v 1:1). Wymieszać fazy przez kilkukrotne odwracanie probówek. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Wirować przez 5 minut przy maksymalnych obrotach mikrowirówki. Zebrać górną fazę do świeżej, jałowej probówki.

7.       Dodać 0,7 ml 96% etanolu. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Wirować 10 min. przy maksymalnych obrotach wirówki. Supernatant odrzucić. Osad przemyć 0,5 ml 70% etanolu. Wirowanie powtórzyć (5 min). Osad suszyć w eksykatorze podłączonym do pompy próżniowej (ten sam efekt można osiągnąć przez suszenie DNA suszarką do włosów). Suchy osad zawiesić w 30 µl buforu TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) uzupełnionego rybonukleazą A do stężenia 100 mg/ml.

8.       DNA analizować przez rozdział elektroforetyczny w 1% żelu agarozowym

 

 

Ó Anna-Karina Kaczorowska