Protokół
laboratoryjny oczyszczania DNA plazmidowego metodą lizy alkalicznej
Wektory plazmidowe – bazy danych na temat wektorów plazmidowych
Baza danych na temat enzymów restrykcyjnych
Istnieje kilkanaście metod oczyszczania
plazmidowego DNA. W każdej z nich kluczowym momentem jest etap oddzielania
plazmidów od chromosomalnego DNA. Większość metod stosowanych do oczyszczania
plazmidowego DNA wykorzystuje fakt jego występowania w formie superzwiniętej (ang. covalently-closed-circular, w skrócie
CCC).
Jedną z najpowszechniej stosowanych technik
oczyszczania plazmidowego DNA jest metoda lizy
alkalicznej zaproponowana przez Birnboima i Doly w 1979 roku. W metodzie
tej, liza bakterii i denaturacja chromosomalnego DNA następuje na skutek
działania alkaliów (0,2 M NaOH) i jonowego detergentu (1% SDS). W warunkach
denaturacji, liniowe cząsteczki
dwuniciowego DNA (chromosom bakteryjny, a także formy plazmidowe OC,
ang. open circular) ulegają rozwinięciu do formy
jednoniciowej, natomiast superzwinięte cząsteczki DNA plazmidowego (CCC)
pozostają dalej splecione i nie ulegają destrukcji. Obecny w mieszaninie lizującej
detergent jonowy - siarczan dodecylu (1%) opłaszcza białka. Konsekwencją
neutralizowania lizatów komórkowych octanem potasu jest wytrącanie
zdenaturowanego chromosomalnego DNA (przypadkowa agregacja jednoniciowych
fragmentów prowadzi do tworzenia nierozpuszczalnych kompleksów) oraz
opłaszczonych siarczanem dodecylu białek (SDS wytrąca się w szczególnie
efektywnie w roztworach zawierających jony potasu).
Metoda lizy
alkalicznej służy do szybkiej izolacji plazmidowego DNA. Otrzymane DNA
nadaje się do analizy restrykcyjnej i sekwencjonowania.
1.
Zaszczepić pojedynczą kolonią szczepu bakteryjnego E. coli JM 109 niosącego plazmid pUC19 w
5 ml pożywki LB uzupełnionej ampicyliną do stężenia 100 mg/ml (hodowlę prowadzić
w probówkach). Bakterie hodować 12 godzin w wytrząsarce wodnej o temperaturze
37°C.
2.
Bakterie osadzić przez wirowanie (1 min. 10000 obr./min).
Supernatant odrzucić. W przypadku oczyszczania wysokokopijnego plazmidu (jest
nim pUC19) wystarczy do jego izolacji użyć 1,5 ml hodowli bakteryjnej
(pojemność probówki Eppendorfa to około 1.8 ml). W innym przypadku należy
osadzić bakterie z 5 ml hodowli.
3.
Osad bakteryjny zawiesić w 100 µl buforu lizozymowego o
składzie: 25 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM glukoza i 10 mM EDTA. Skutecznym
sposobem na zawieszenie bakterii we wspomnianym buforze jest pocieracie dnem
probówek o otwory w statywie.
4.
Dodać 200 µl świeżo przygotowanej mieszaniny lizującej NaOH/SDS
(9 części 0,2 M NaOH i 1 część 10 % SDS). Całość delikatnie wymieszać przez
kilkukrotne odwrócenie probówki. Inkubować na stole przez 5 minut.
5.
Dodać 150 µl roztworu octanu potasu (przygotowuje się go przez
zmieszanie 60 ml 5 M octanu potasu, 11,5 ml lodowatego kwasu octowego i 28,5 ml
wody). Zawartość probówki wymieszać przez energiczne wytrzasąnie.
6.
Dodać 300 µl mieszaniny zbuforowanego fenolu i chloroformu (w
proporcji v/v 1:1). Wymieszać fazy przez kilkukrotne odwracanie probówek.
Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Wirować przez 5 minut przy
maksymalnych obrotach mikrowirówki. Zebrać górną fazę do świeżej, jałowej
probówki.
7.
Dodać 0,7 ml 96% etanolu. Inkubować w temperaturze pokojowej
przez 15 minut. Wirować 10 min. przy maksymalnych obrotach wirówki. Supernatant
odrzucić. Osad przemyć 0,5 ml 70% etanolu. Wirowanie powtórzyć (5 min). Osad
suszyć w eksykatorze podłączonym do pompy próżniowej (ten sam efekt można
osiągnąć przez suszenie DNA suszarką do włosów). Suchy osad zawiesić w 30 µl
buforu TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) uzupełnionego rybonukleazą A do
stężenia 100 mg/ml.
8.
DNA analizować przez rozdział elektroforetyczny w 1% żelu
agarozowym
Ó Anna-Karina
Kaczorowska